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图２　术后 8周，移植体软骨环消失，移植体软化

图４术后４周， rhBMP-2植入区可见新生软骨细胞聚集，固有的软骨膜处有少量新生软骨（ HE ╳ 100，图例同上）

[摘要] 目的 重组人骨形态发生蛋白－ 2 ( rhBMP-2 )植入犬的自体气管移植体诱导软骨再生。 方法 24条犬等分为3组：A组原位再植，外覆带蒂大网膜；B组移植体植入 rhBMP-2 后埋入腹腔大网膜中； C组移植体植入 rhBMP-2 后原位再植，外覆带蒂大网膜。术后 1、2、4、8周处死动物，标本行大体及组织学观察。 结果 3组移植体软骨环均有不同程度的吸收。B和C组移植体的 rhBMP-2 植入区有软骨再生，且两者新生软骨面积差异有显著性（ u=841, P <0.05）。 结论 rhBMP-2 可刺激气管移植体软骨再生；胶原可充当 rhBMP-2 的缓释载体，用于气管移植有较好的诱导软骨再生作用。

[关键词] 气管；移植；骨形态发生蛋白

Regeneration of autografted cartilage in dog's tracheal transplantation

LI Xiao-Fei, Cheng Qing-Shu, WANG Dao-Xi, et al.

Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038 China

[Abstract] OBJECTIVE: The aim of this research was to verify the validity and potential application of implanting the recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into the tracheal autograft to induced regeneration of dog's tracheal cartilage for the purpose of preventing the collapse of the trachea in consequence of softening and absorption of the cartilage on the transplanted autograft. METHODS: Twenty-four mongrel dogs were randomly and equally divided into group A, B and C. A five-ring cervical tracheal segment was harvested as the autograft. In group A, the graft was reimplanted and wrapped with pedicled omentum. In group B, the graft was heterotopically transplanted into the omentum after that rhBMP-2 with collagen as carrier was injected into the soft tissues between cartilaginous rings of the autograft. In group C, after injection of rhBMP-2 the graft was reimplanted with omentopexy as group A. The animals were sacrificed on postoperative 1, 2, 4 and 8 weeks, and the postmortem specimens were examined grossly and histologically. RESULTS: Cartilage rings were absorbed in all three groups with varying degree. In group B and C, new cartilage was induced in the rhBMP-2 injected area and more new cartilage was observed in group B than in group C （ u=841, P <0.05 ） . CONCLUSION: These results indicated that the rhBMP-2 had ability to induce new cartilage formation in the tracheal autograft. The collagen was effective as a carrier of rhBMP-2 and could enhance the ability of rhBMP-2 to induce cartilage regeneration in tracheal transplantation.

[Keywords] trachea ； transplantation ； bone morphogenetic proteinx

气管移植体的软骨软化吸收造成的软化性狭窄始终阻碍着气管移植的发展 [1] 。我们用重组人骨形态发生蛋白－ 2（rhBMP-2）胶原缓释系统植入犬的自体气管移植体，诱导软骨再生，试图形成弹性支架，从而避免气管移植体软化性狭窄。

材料和方法

１．材料及制备： (1)rhBMP-2：由第四军医大学西京医院全军骨科研究所提供，小鼠肌袋生物学活性试验证实其诱导成骨活性良好。(2)胶原的制备：根据李亚非等 [2] 方法制备Ⅰ型胶原溶液，冻干保存备用。 (3)rhBMP-2／胶原缓释系统的制备：取320 mg胶原冻干品，溶于适量盐酸溶液，使其成为较粘稠的液体。rhBMP-2干粉64 mg溶于适量灭菌水后，与胶原溶液充分混匀。再将此rhBMP-2／胶原溶液均匀分成16份。环氧乙烷消毒，密封保存备用。制备的每份复合物含rhBMP-2 4mg，胶原20 mg。

２．实验动物及手术方法： (1)实验动物及分组：健康成年杂种犬24条，均为雄性，体重13～18 kg。随机等分为3组：A组为空白对照组，自体气管原位移植； Ｂ 、 C组均为rhBMP-2植入组，其中B组为异位移植组，C组为原位移植组。(2)麻醉及手术方法：2.5％戊巴比妥钠麻醉。颈正中切口，切取一５环气管段。青霉素生理盐水溶液冲洗后，A组迅速原位再植。腹正中切口，游离大网膜，并将其经皮下隧道拉至颈部，包绕气管移植体及上下吻合口。B组切取５环气管段后，上下残端直接对端吻合。切取段经上述方法冲洗后，植入rhBMP-2／胶原复合物，然后将移植体包埋入腹腔大网膜内。C组移植体同样植入rhBMP-2／胶原复合物，其他手术方法同Ａ组。(3)rhBMP-2／胶原缓释系统植入方法：取上述rhBMP-2／胶原复合物冻干品1份，用生理盐水溶解至4 ml，呈半透明较粘稠液体。抽吸入５ml注射器内，采用多点环形注射方式，分别注射入上述移植体的各软骨环间隙内，环间组织内各注射入rhBMP-2／胶原复合物1 ml。即各环间分别植入rhBMP-2　1 mg，胶原5 mg（图1）。

３．术后处理及取材时间：所有犬均于术后立即给予长效青霉素肌注，并接受相同喂养。各组实验犬分别于术后 1、2、4、8周各处死2条。

４ . 观察指标：实验犬生存情况，标本大体及组织学改变， 移植体新生软骨面积的 定量组织学分析。面积定量分析采用 高清晰度彩色病理图像分析仪测定，方法是将各组 4 周时处死动物的气管移植体标本的软骨部均匀地从 6 处纵形取材、 切片、苏木素 -伊红染色后，以每一取材部位的相邻软骨环间区域为测定区，即分别测定软骨环间rhBMP-2复合物植入区及其两侧的固有的软骨膜外新生软骨区。

结果

1. 动物的存活情况：A组，除1条犬术后30d死于突然窒息，其余犬全部存活达到预杀期。B组，全部动物存活达到预杀期。C组，1条犬术后7d因手术切口感染而死亡，其余动物全部存活达到预杀期。A组与C组犬，普遍术后1～2周内仅有呼吸道刺激表现， 3～4周开始出现呼吸困难，仅２条犬伴有较严重的呼吸困难现象。

2. 大体改变：(1)术后1周，3组犬标本表现大致相同，大网膜与移植体气管粘连；管腔正常；气管软骨环保持良好；A组与C组吻合口愈合良好。(2)术后2周，大网膜与气管粘连紧密；管腔未见缩窄； A组与C组移植体软骨环已有部分破坏，B组移植体气管软骨环保持完整。(3)术后4周，大网膜与气管粘连紧密；管壁增厚，管腔缩窄,最窄处直径仅0.4 cm；A组与C组移植体气管软骨环已不完整，成片段状，B组软骨环保持较完整。(4)术后8周，大网膜与气管粘连紧密；吻合口与上下气管残端紧密结合；移植体管壁明显增厚，管腔缩窄，A组与C组移植体气管软骨环成片段状或消失，B组气管软骨环保持较完整。（图 2）

表 1 各组新生软骨的比较

a P <0.001, vs A b P <0.05, vs B

3. 组织学表现：(1)术后1周，移植体粘膜部分脱落，新鲜肉芽组织向腔内生长，中性粒细胞浸润；可见软骨坏死、吸收现象。B组与C组软骨环间rhBMP-2复合物植入区可见结构紊乱的胶原深染，周围有少量炎性细胞浸润，并可见少量间充质细胞聚集。(2)术后2周，移植体大量肉芽组织向腔内生长，淋巴细胞和中性粒细胞浸润；软骨坏死，吸收。B组与C组软骨环间植入胶原部分被吸收，吸收后的间隙为纤维血管组织占据，其内可见少量新生软骨细胞，细胞外软骨基质较丰富（图 3）。(3)术后4周，移植体肉芽组织向腔内增生明显；管腔内大部分覆盖单层立方上皮和鳞状上皮；A组与C组的固有软骨大部分坏死，溶解，Ｂ组软骨保持尚好。各组均有标本软骨膜处有少量新生软骨，且B组与C组的软骨膜处新生软骨较A组更为明显；B组与C组软骨环间rhBMP-2复合物植入区胶原仍可见少量残留，其间可见较多的成熟软骨细胞聚集，细胞外基质丰富，未见到基质内钙化现象。（图4） (４)术后8周，移植体管腔内大部分覆盖假复层柱状纤毛上皮，中性粒细胞浸润减少；A组与C组的固有软骨环大部分被吸收，Ｂ组软骨环保持较其他组好；B组与C组rhBMP-2复合物植入区仍见到新生的软骨组织，偶有新生软骨细胞出现坏死。

4. 定量组织学结果：将各组织切片在统一的倍数下观察，计算各环间成软骨的像素面积（表1）。以SPSS 10.0软件统计，用 Kruskal-Wallis 非参数检验（方差不齐）以及 Mann-Whitney U 检验， 比较新生软骨面积。 3组间整体比较差别有显著性 ( x2 =47.11， P < 0.05)；两两比较：B组、C组均与A组差异有显著性（u 1 =340, P <0.0015, u 2 =521, P <0.001）,而且B组与C组间比较差异有显著性（u 3 =841, P <0.05）。

讨论

气管移植进展缓慢的主要原因是移植体的缺血、免疫排斥反应等因素导致移植体软化和狭窄 [1] 。本课题首次把 BMP复合胶原应用于气管移植，目的是促进移植气管软骨的再生，克服移植体气管的塌陷。

本次实验采用大网膜包绕移植体提供血液供应 [1 ， 3 ， 4] 。在实验中发现直接植入大网膜组（ B组）动物的标本中移植体的固有软骨环的软化现象明显轻于原位移植组（C组）的标本，而且B组的移植体成软骨量要多于C组。因此，血供的不同可能影响移植体内软骨的再生。

骨形态发生蛋白质（ BMP）具有促进异位诱导成骨及成软骨的作用 [5] [6] 。但 BMP在诱导成骨时必须有合适的缓释载体 [7] 。本实验所采用的胃蛋白酶处理的牛腱胶原去除了其中主要引起免疫反应的Ⅰ型胶原的肽端，抗原性很弱，结果证明是比较合适的缓释载体。

本实验诱导出的软骨组织不足以形成有效的生物支架，所以各实验组仍有移植体软化现象。分析其原因可能与以下因素有关： (1)BMP的浓度仍偏低。(2)大动物对BMP的反应欠佳 [8] 。 (3)移植体气管组织局部的成骨微环境差。移植体气管早期缺血和易于感染、局部炎症反应较重与血运丰富的肌肉组织中BMP诱导骨形成存在差异。

初步研究可证明 BMP在气管移植体内可诱导软骨再生。今后我们就改进BMP的用量、病理变化及移植体的血供进行深入系统的研究，使BMP诱导出大量新生软骨组织并形成支撑。

参考文献

•  Maksoud JG, Rodrigues CJ, Tannuri U, et al. The effects of early and delayed immunosuppression in experimental tracheal transplantation with omentopexy. J Pediatr Surg , 1999, 34: 1223-1228.

•  李亚飞，张晶，胡蕴玉等 . 应用胃蛋白酶消化的牛腱胶原作为骨形态发生蛋白的缓释载体 . 中华骨科杂志 , 1996, 16: 53-55.

•  Nakanishi R; Shirakusa T; Takachi T. Omentopexy for tracheal autografts. Ann Thorac Surg, 1994, 57: 841-845.

•  Li J; Xu P; Chen H. Successful tracheal autotransplantation with two-stage approach using the greater omentum. Ann Thorac Surg , 1997, 64: 199-202.

•  Yoshida K, Bessho K, Fujimura K, et al. Osteoinduction capability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in intramuscular and subcutaneous sites: an experimental study. J Craniomaxillofac Surg , 1998, 26: 112-115.

•  Cui PC, Chen WX, Zhou HM. Repair of thyroid cartilage defect with bone morphogenetic protein. Ann Otol Rhinol Laryngol , 1997, 106: 326-328.

•  Hotz G, Herr G. Bone substitute with osteoinductive biomaterials-current and future clinical applications. In J Oral Maxillofac Surg , 1994, 23: 413-417.

•  马秦，毛天球，刘宝林等 . rhBMP-2 、胶原和珊瑚复合人工骨在不同种类动物体内异位诱导新骨形成的实验研究 . 口腔颌面外科杂志 , 1999, 9: 206-208.